论文代写

雞朊蛋白調節DF-1細胞活性的初步研究

發布時間:2018-11-20 17:29 論文編輯:lgg

本文是醫學碩士論文代寫案例,一直以來,臨床醫生和科學家們困惑于腫瘤細胞同時獲得避免免疫監視機制和逃避細胞毒性作用的能力。腫瘤干細胞的概念和對乳腺癌基因的研究表明。

第一章 緒 論


1 朊蛋白生理功能的研究進展
朊病毒病是一種由朊病毒導致的傳染性神經退行性疾病,主要包括人的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)、致死性家族失眠癥等和動物的傳染性海綿樣腦病[1]等。這些疾病都是由于細胞中PRNP基因編碼的正常細胞型朊蛋白(cellular isoform of prionprotein,PrPC)轉變為異常的癢病型朊蛋白(scrapie isoform of prion protein,PrPSc)所致。當PrPSc序列中富含β折疊的區域與PrPC結合后會使后者構象轉變為PrPSc,從而發生無核酸感染[1,2]。由于這種構象轉換和隨后的異常都需要PrPC的存在,因此當不存在內源性PrPC時,PrPSc就不再具有傳染性和神經毒性[3]。在新變型和零星的克雅氏病患者和一些傳染性海綿樣腦病動物體中已經證明朊病毒不僅在中樞神經系統積累,而且也存在于淋巴器官[4]。新的研究發現,對于朊病毒在細胞間轉移中細胞通訊隧道小管(tunneling nanotubes,TNTs)是十分重要的[5]。最新報告指出,在基質細胞的炎性肉芽腫中朊病毒的復制依賴于淋巴毒素[6]。不僅PrPSc的致病過程仍存在諸多疑問,對于PrPC正常功能的研究也不完全。目前已知哺乳動物的PrPC有多種功能,它不僅參與細胞的代謝、粘附[8]、分化和凋亡,還參與了細胞金屬離子轉運[7]、跨膜信號轉導[9]、氧化應激和免疫調節等過程。近期多篇外文文獻對不同朊病毒病的致病通路和表型變異進行了綜述[4,10-12]。最新研究表明,PrPC不僅在神經系統起著基本的作用,還可能參與人類癌癥細胞的抗細胞凋亡、擴散和轉移等過程。PrPC廣泛存在于多種物種中[4],首次對PrPC基因敲除小鼠的研究[13]表明,PrPC與小鼠的神經系統功能密切相關。然而,PrPC確切的生物功能遠不止如此,除了與神經系統功能相關外,許多敲除或高表達PrPC轉基因小鼠的研究發現,PrPC不僅在神經系統中發揮重要作用,還在其他器官中參與許多生物過程。
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2 PI3K/Akt 信號轉導通路的研究進展
20 世紀 80 年代初期,在嘗試闡明胰島素受體信號時發現受體酪氨酸激酶(receptort yrosine kinases,RTKs)可識別與激活 PI3K/Akt 通路[45-46]。在研究 PI3K/Akt 通路對于腫瘤發生作用的同時,也發現了該途徑的負調控物,如蛋白磷酸酶 2(protein phosphatase 2,PP2A)、 蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTP)、PH-結構域富重復亮氨酸蛋白磷酸酶(PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase, PHLPP1/2)。PI3K/Akt通路作為高度保守的一條途徑,它的激活受著多過程的嚴格調控(圖 1-1)。激活的受體通過其調節亞基或其他相關分子,如胰島素受體底物(insulin receptorsubstrate,IRS)蛋白,可直接作用于一級 PI3Ks,PI3K 激活后其催化區可轉換為 3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphat idylinositol 3,4-bisphosphate,PIP2)、3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatid ylinositol 3,4,5-trisphos-phate,PIP3)。Akt與 PIP3 在質膜上結合后,磷脂酰激酶 依 賴 激 酶 1(phosphatid ylinositol dependent kinase,PDK1)便作用于Akt 使其磷酸化[47],通過 mTOR[48]或 DNA-PK[49]磷酸化Akt Ser473的羧基疏水端激活Akt。Akt 介導許多細胞功能,包括血管生成、新陳代謝、生長增殖、蛋白質合成、轉錄和細胞凋亡(圖 1-2)。
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第二章 雞Akt基因mRNA的SYBR GreenⅠ實時定量 RT-PCR 檢測法建立


Akt 又稱 PKB,即蛋白激酶 B,是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在細胞存活和凋亡中起重要作用。Akt 是原癌基因 c-akt 的表達產物,它參與生長因子激活的經 PI3K 介導的信號過程,可以在多種生長因子、細胞因子、激素的激活作用下或者 PTEN 的失活刺激其活化。Akt 活化后,能夠激活細胞的抗凋亡機制,調節蛋白合成及葡萄糖代謝等過程,進而在抑制細胞凋亡的同時,促進細胞的生長與增殖。因此,調節 Akt 基因表達可改變細胞增殖與凋亡的平衡,達到抑制腫瘤生長的目的。蛋白激酶 Akt 作為磷脂酰肌醇-3 激酶的下游分子,廣泛參與細胞各種功能調節。實時熒光定量 RT-PCR 技術,即將熒光基團摻入到 PCR 反應體系中,通過熒光信號的積累來實時監測整個 PCR 進程,是當前檢測基因轉錄的最靈敏和準確的方法之一[107-109]。其中 SYBR GreenⅠ熒光染料法以成本低、方便等優點而被廣泛使用。目前國內外尚無針對雞 Akt 基因的熒光定量 PCR 檢測方法。為快速檢測雞細胞增殖能力,本章利用 SYBR GreenⅠ實時定量 RT-PCR 技術,建立了雞 Akt(chAkt)基因 mRNA 的定量分析方法。
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2 結果與分析
以 DF-1 細胞 cDNA 為模板分別用特異性引物 PCR 擴增目的基因 Akt 和 β -actin,經瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增出與預期片段大小(Akt 基因 175bp,β -actin 基因 190bp)相符的產物(圖 2-1)。經凝膠回收純化的 Akt 和 β -actin 基因擴增產物與 pMD18-T 連接、轉化 E.coli DH5α 后,篩選陽性克隆并經 PCR 鑒定,獲得疑似重組質粒 pMD 18-Akt、pMD18-β -actin(圖 2-2),經測序和 BLAST 分析表明,重組質粒的目的基因核苷酸序列與GenBank 中注冊的雞 Akt 和 β-actin 的同源性達 100%,即目的基因克隆成功。取 10 倍梯度稀釋的雞 Akt 和 β -actin 基因 pMD 18-Akt、pMD 18-β -actin 的重組質粒標準品,分別進行 RT-PCR 擴增,建立了以目的基因拷貝數的對數值為橫坐標、Ct 值為縱坐標的 RT-PCR 標準曲線(圖 2-3 和 2-4),Akt 基因標準曲線表達式為 y=-3.437x+42.78,β -actin 基因標準曲線表達式為 y=-3.506x+44.18。針對雞 Akt 和 β -actin 基因的 RT-PCR 標準曲線的線性范圍均達到 107,檢測的重組質粒濃度分別在 2.41×104~2.41×1010和 4.21×104~4.21×1010拷貝/μL 之間,得到擴增動力學曲線,不同濃度的質粒模板隨循環數的增加,其熒光強度逐漸增強。擴增反應靈敏度均為 104copies/μL。其對數與相應 Ct 值(循環閾值)均具有良好的相關性,決定系數(R2)分別為 0.9773 與 0.9513,并由 Roche LightCycler480Ⅱ計算出反應的擴增效率分別為 94.06%和 92.85%。

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第三章 渥曼青霉素對雞DF-1細胞與朊蛋白過表達DF-1細胞增殖....... 19
1.1 材料 ..... 19
1.1.1 細胞 ..... 19
1.1.2 主要試劑 .... 19
1.1.3 主要儀器 .... 19
1.2 方法 ..... 20
2 結果與分析 ....... 21
2.1 渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制 DF-1 細胞粘附......... 21
2.2 渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制 DF-1 細胞侵襲......... 24
2.3 渥曼青霉素以劑量和時間依賴方式抑制 DF-1 細胞增殖.... 25
2.4 渥曼青霉素以劑量依賴方式促進 DF-1 細胞凋亡 ........ 26
2.5 不同渥曼青霉素濃度下 PrPC基因的表達差異分析...... 30
论文代写 3 討論..... 30


3 討論


PrPC通過表達量、交聯形式和與相關蛋白的互作等方式參與多個信號途徑的調節,如PI3K/Akt、環 腺 苷 酸 / 蛋 白 激 酶 A( PKA )、 蛋 白 激 酶 C(PKC)、Fyn和Erk1/2等途徑。PrPC在活細胞中參與調節增殖、分化、細胞粘附、細胞轉運和跨膜等多個胞內信號通路。Akt 是在人類癌癥最常見的蛋白激酶,Akt 的活性與抗細胞凋亡以及細胞生長、增殖和能量代謝有關。在腫瘤細胞中 Akt 的表達量較正常細胞高,有加速細胞增殖和抑制細胞程序性死亡的作用。因此,抑制 Akt 的活性一直被視為一個有吸引力的干預治療腫瘤的方法。然而,逐漸發現 Akt致癌基因也可以防止腫瘤細胞轉移。在人類乳腺癌細胞中超表達磷酸化 Akt 活性,從而目標腫瘤結節性硬化癥 2(tuberous sclerosis complex 2,TSC2)降低,減少肌動蛋白纖維粘連,降低腫瘤細胞運動性和轉移。激活 Akt 可改變細胞遷移和侵襲,活躍的 Akt 可以提高癌癥細胞侵襲能力,但 Akt 還可以在正常細胞上產生相反的效果。在一項研究中發現,磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphatid ylinositol 3-kinase,PI3K)的激活通過增加 Rac1 的活性,并刺激 Akt 表達量的升高,促進細胞增殖,從而擾亂了正常的組織極性。本實驗顯示,ChPrPC在 DF-1 細胞中的大量表達與促進該細胞增殖、粘附和侵襲,抑制細胞凋亡等過程相關。加入 PI3K 抑制劑渥曼青霉素后,能顯著抑制細胞增殖、粘附和侵襲并誘導細胞凋亡,且作用與藥物濃度呈正相關。流式細胞儀凋亡率的檢測證實,細胞增殖、粘附和侵襲受抑制可能與渥曼青霉素誘導的細胞凋亡有關,且當低濃度時誘導凋亡能力不明顯,但隨渥曼青霉素濃度加大凋亡率明顯增加。
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結 論


1. Akt基因的表達量與PRNP的表達量密切相關,提示ChPrPC可能參與了Akt的激活,并且Akt對PrPC可能存在反饋調節。
2. ChPrPC參與DF-1細胞增殖、粘附、侵襲與凋亡的過程,可促進DF-1細胞的增殖、粘附和侵襲,抑制DF-1細胞的凋亡。
3. 加入PI3K/Akt信號轉導通路的抑制劑渥曼青霉素后,可明顯抑制DF-1細胞的增殖、粘附和侵襲,并促進DF-1細胞凋亡,且作用于藥物濃度呈正相關。相比正常的DF-1細胞,DF-1-PrP細胞受到渥曼青霉素(濃度低于50nmol/L)的影響較小,這說明過表達的PrPC還可通過其他途徑調節DF-1細胞的增殖、粘附和侵襲的能力。
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參考文獻(略)

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