论文代写

BPV VP1蛋白和BCoV N蛋白抑制宿主I型干擾素應答的分子機制研究

發布時間:2021-08-21 18:04 論文編輯:vicky
本試驗建立了以 BCoV N 基因、BPV VP1 基因為監測靶基因的單重 TaqManqRT-PCR 檢測方法。本試驗建立了以 BCoV N 基因和 BPV VP1 基因為監測靶基因的 BPV 和 BCoV 雙重 TaqMan 熒光定量 qRT-PCR 檢測方法。

第一章 文獻綜述

1 牛細小病毒概述
牛細小病毒(Bovine parvovirus, BPV)是一種無包膜的單股線性 DNA 病毒,屬于細小病毒科細小病毒亞科牛犬細小病毒屬成員,犬極小病毒(Minute virus ofcanines, MVC)、人博卡病毒(Hunman bocavirus, HBoV)[1-3]也是該屬成員,BPV 流行可引起犢牛腹瀉疾病,且與牛繁殖障礙相關[4]。BPV 可通過胎盤由妊娠母牛傳播給胎牛引起流產和死胎,犢牛感染 BPV 可呈消化機能障礙。宿主消化道粘膜細胞是BPV 易感部位,易感細胞感染后出現皺縮、扁圓、溶解等病變現象[5-7]。
1961 年 Abinanti 和 Warfiled 初次從健康犢牛胃腸道分離鑒定出 BPV,因其具有血細胞吸附性,命名為紅細胞吸附腸炎病毒(Hemadsorping enteria, HADEN)病毒,1966 年日本科研人員從腹瀉犢牛糞便和流產胎牛中分離出 BPV,其中 C134 株與 HADEN 病毒株特性不同,HADEN 株和 C134 株分別被定義為 1 型和 2 型 BPV,隨后,我國學者從犢牛鼻液中分離出 BPV(B-2 株),美國學者從犢牛腹瀉糞便中分離出 BPV,目前該病在全球范圍內流行[8-10]。
BPV 呈球形或六角形,以完整病毒粒子或空衣殼病毒粒子形式存在,基因組長度為 5.5kb[11-13]。基因組兩端存在回文發夾結構,基因組包括三個開放閱讀框(Openreading frame, ORF),從 5′端到 3′端依次為 ORF1 編碼非結構蛋白 1(Nonstructuralprotein 1, NS1)、非結構蛋 2(Nonstructural protein 2, NS2),ORF2 編碼核磷蛋白(Nuclear phosphoprotein, NP)和 ORF3 編碼病毒衣殼蛋白 1(Capsid viral protein 1,VP1)和核衣殼蛋白 2(Capsid viral protein 2, VP2)。細小病毒屬 5′端 ORF 序列保守,同源性較高,3′ 端 ORF 序列較 5′端為可變序列[11-13]。
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2 牛冠狀病毒概述
牛冠狀病毒(Bovine coronavirus, BCoV)屬于套式病毒目,冠狀病毒科,β冠狀病毒屬 2a 亞群成員[23],是導致牛腹瀉的主要病原之一,牛群感染 BCoV 后,犢牛出現水樣腹瀉,成年牛冬痢,腸出血、脫水、消瘦等癥狀[24-26]。該病無季節性,在世界范圍廣泛分布,給牛場帶來了嚴重的經濟損失[27-28]。
BCoV 是單股正鏈 RNA 病毒,基因組長度為 27~32kb,包括 13 個 ORFs,兩側有 5′和 3′非編碼區(Untranslated region, UTR)。基因組 5′端 2/3 的區域編碼木瓜樣蛋白酶(Papain-like protease, PLP)和 3C 樣蛋白酶(Chymotrypsin-like protease,3Cpro)兩個水解蛋白酶,水解產生 16 個非結構蛋白(Nonstructural proteins,nsp1~nsp16),后 1/3 的區域編碼血凝素-乙酰酯酶糖蛋白(Hemagglutinin-esterase,HE)、纖突蛋白(Spike, S)、小衣殼蛋白(Envelope, E)、跨膜蛋白(Membrane,M)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid, N)五個結構蛋白和幾個輔助蛋白[29-30]。HE、S、E、M 蛋白位于病毒包膜表面,與病毒的裝配和宿主細胞識別相關,HE 蛋白是 A亞群特有的蛋白,可介導病毒顆粒與 O-乙酰唾液酸的結合;S 蛋白與 HE 蛋白功能相似,是病毒的主要抗原位點并決定病毒組織或宿主噬性;E 蛋白和 M 蛋白主要參與病毒的裝配過程[31]。N 蛋白位于病毒衣殼內,基因序列高度保守,包裹基因組形成核蛋白復合體,在病毒致病性、轉錄、翻譯和復制方面起重要作用[29]。
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第二章 BPV VP1 蛋白抑制 IFN-β產生的分子機制

1 實驗材料
1.1 細胞、質粒和病毒株
1.1 細胞、質粒和病毒株
1.1 細胞、質粒和病毒株
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2 實驗方法
2.1 細胞復蘇與培養
液氮罐中取出凍存細胞,置于溫水中迅速搖晃使細胞凍存液快速融化,待融化后,低速離心機 300×g 離心 10min,75% 乙醇對細胞凍存管表面消毒,棄去凍存液,加入 1mL 培養基重懸細胞,后轉入 T25 培養瓶中,添加 6ml 新鮮培養基,37℃、5% 二氧化碳培養箱繼續培養。根據細胞生長狀態,換液或傳代。
細胞傳代培養:細胞培養至密度達 80% 以上,即可進行傳代培養。試驗前,室溫或 37℃水浴平衡培養基和胰酶,75% 乙醇對細胞瓶表面消毒 3 次。無菌條件下棄去細胞瓶中培養基,無血清培養基清洗 1 次,加入 1ml 胰酶,顯微鏡下觀察,待大部分細胞不再貼壁,棄去胰酶,加入適量培養基,用吸管輕輕吹打細胞。根據試驗安排將細胞懸液均勻分成幾份,37℃、5% 二氧化碳培養箱繼續培養。
2.2 BPV 毒株的培養與增殖
BT 細胞傳代培養 6~8h,顯微鏡下觀察,細胞培養至密度達 50~60%,棄去生長液,無血清 DMEM 培養基漂洗三次,以細胞瓶 1/10 體積的 BPV 毒液接種細胞,培養箱中孵育 2h,棄去多余毒液,加入適量含 2% FBS 的 DMEM 維持液,于 37℃、5% 二氧化碳培養箱中繼續培養,逐日觀察細胞狀態,待細胞出現 CPE,細胞收于-80℃超低溫冰箱。其后將細胞反復凍融 3 次,離心收集上清,-80℃保存備用。
2.3 BPV 病毒 TCID50 測定
BT 細胞鋪 96 孔板,培養過夜,待細胞生長至 90%, 吸去生長液,用無血清DMEM 培養基輕柔洗三次,用無血清 DMEM 培養基將 BPV 病毒液作連續 10 倍的稀釋,從 10-1~10-10。 將稀釋好的病毒液接種到 BT 單層細胞上,每一稀釋度接種一縱排共 8 孔,每孔接種 100µl,正常細胞對照作兩縱排。接毒后于 37℃、5% 二氧化碳培養箱中培養 2h 后棄去毒液,換為含 2% FBS 的 DMEM 維持液,逐日觀察并記錄結果,Reed-Muench 兩氏法判定結果。
表 2-1 引物序列信息
表 2-1 引物序列信息

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第三章 BCoV N 蛋白抑制 IFN-β產生的分子機制...........................................27
1 實驗材料.......................................27
1.1 細胞、質粒和病毒....................................27
1.2 主要試劑................................27
第四章 BCoV、BPV 單重 TaqMan qRT-PCR 方法建立............................. 37
1 BCoV 單重 TaqMan qRT-PCR 方法建立................................37
1.1 實驗材料與方法...................................37
1.2 結果...........................................42
第五章 BPV 和 BCoV 雙重 TaqMan qR T-PCR 檢測方法的建立............... 53
1 實驗材料與方法.............................................53
1.1 臨床病料和病毒株........................................53
1.2 主要試劑及儀器...............................................53

第五章 BPV 和 BCoV 雙重 TaqMan qRT-PCR 檢測方法的建立

1 實驗材料與方法
1.1 臨床病料和病毒株
BPV Haden 株、BPIV 均購買自 ATCC。BCoV 陽性株由西南民族大學惠贈。BVDV NADL 株由甘肅省動物細胞工程技術研究中心保存。RABV 滅活疫苗由中國農業科學院蘭州獸醫研究所惠贈。BHV、BAV、PEDV、BRV 均由生物醫學中心保存。臨床檢測樣本(59 份)為蘭州市、張掖市部分牛場的犢牛腹瀉糞便樣品。
1.2 主要試劑及儀器
主要試劑及儀器同第四章 1.1.2。
1.3 引物和 TaqMan 探針的設計
本試驗參考第四章建立的 BCoV TaqMan qRT-PCR 和 BPV TaqMan qRT-PCR 檢測方法中的引物信息,進行引物、探針合成,引物序列見表 4-1 和 4-10。
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第六章 全文總結


1、BPV 非結構蛋白 NS1 蛋白顯著(P<0.01)抑制 BPV 的體外增殖,結構蛋白 VP1蛋白極顯著(P<0.001)促進 BPV 的體外增殖。
2、BPV VP1 可顯著(P<0.01)抑制 VSV 介導的 IFN-β產生,可抑制 JAK/STAT 通路下游因子 Mx、OSA、ISG15、ISG56 轉錄水平的表達。
3、BPV VP1 可抑制外源關鍵因子誘導的 IFN-β的產生,同時可抑制 TBK1 和 IRF3(5D)誘導的 TBK1 及 IRF3 轉錄水平的表達。
4、BCoV N 蛋白可顯著(P<0.01)抑制 VSV 介導的 IFN-β產生,且存在劑量依賴。
5、BCoV N 蛋白可抑制 MDA5、MAVS、TBK1 及 IRF3(5D)誘導的 IFN-β mRNA水平的表達。
6、BCoV N 可抑制 MDA5、MAVS、TBK1 和 IRF3(5D)誘導的 MDA5、MAVS、TBK1、IRF3 轉錄水平的表達。
7、本試驗建立了以 BCoV N 基因、BPV VP1 基因為監測靶基因的單重 TaqManqRT-PCR 檢測方法。8、本試驗建立了以 BCoV N 基因和 BPV VP1 基因為監測靶基因的 BPV 和 BCoV 雙重 TaqMan 熒光定量 qRT-PCR 檢測方法。
參考文獻(略)

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